오미트론 확진자를 PCR 검사로 안된다구?


PCR 작동 기본 원리와 인식론적 의미

q RT-PCR
quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
정량적 역전사 중합효소 연쇄반응
(2021년12월 씀)


PCR 진단기 돌리기 전에 해야 할 일들,,

코로나 바이러스를 RNA 바이러스라고 하는데, 코비드 바이러스가 내 몸으로 들어 왔다면 내 코 속에서 채취된 검체물 안에 해당 RNA가 있을 것이다. 이 RNA를 검출하는 것이 진단 과정에서 첫 번째 과정이다.

진단을 하려면 대상 유전체를 다량 복제하여 일정량의 유전자를 확보해야 한다. 그런데 RNA바이러스는 그 자체복제로 증폭되지 않는다. 어려운 말로 해서 RNA는 자신의 탬플릿을 만들 수 없다. 그래서 PCR 진단 전단계로서 RNA를 증폭가능한 DNA로 전환시켜 놓아야 한다.

왜 PCR 앞에 RT라는 형용사를 붙이는지,,

보통 DNA는 단백질 구성을 위한 정보를 제공한다. 단백질 구성을 위해 정보를 옮겨야 하는데 이런 정보 이동을 DNA가 직접 하지 않고 RNA가 대신 맡아서 한다. 이를 위하여 DNA는 당연히 RNA로 바꿔져야 한다. 이런 전환을 전사transcription이라고 말한다. 전사된 RNA에서 단백질 구성에 필요한 정보 매신저를 담은 RNA를 메신저 즉 mRNA라고 부르고 그런 mRNA를 날라다주는transfer RNA를 tRNA라고 부른다. (중학교 교과서에 나오는 수준입니다.)

그런데 코로나바이러스처럼 원래 RNS로 된 바이러스를 복제하여 증폭시커려니 해당 RNA를 거꾸로 DNA로 전환시켜줘야 한다. 이런 과정을 거꾸로 전사한다하여 역전사(reverse transcription; RT)라고 말한다.(고교 과학에 나오는 수준입니다.) 그래서 역전사의 첫 글자 RT를 따서 RT-PCR 이라고 한다.

역전사된 DNA를 왜 cDNA라고 하는지,,

역전사 과정에서 원래 RNA 구조와 역전사되는 DNA 구조는 당연히 서로 같아야 할 것이다. 즉 역전사된 DNA는 원래의 RNA와 상보적complementary이니까, 그 c를 따와서 cDNA라고 부른다.

PCR 과정이 3 단계로 된다는데,,

이제 최초로 복제된 cDNA를 빠르게 복제하여 그 수를 늘려야 하는데, 여기부터 PCR 과정이라고 볼 수 있다. PCR 단계는 크게 3 단계이다. (i)cDNA의 사슬을 두 가닥으로 풀어서 그 구조를 완전히 깨는 변성denaturation 단계가 첫째 과정이다. (ii)풀어진 가닥 하나마다 복제를 잘 되게 하는 준비과정으로 그런 단일가닥이 하나의 탬플릿이 된다. 탬플릿 DNA에 일종의 결착유발자인 프라이머primer를 단단히 붙이는 프라이머 결합annealing 단계가 둘째이다. (iii)결착유발자를 붙인 DNA 가닥 (끝) 부분을 확장extension하여 DNA 탬플릿 길이까지 늘리는 신장Elongation 단계로서 복제의 한 사이클이 완성된다.

그 중에서 첫 단계를 왜 변성denaturation이라고 부르는지,,

쇠로 칼 만드는 대장간의 모습을 상상으로 떠올려보자. 우선 쇠를 높은 온도의 화로에 넣어 고체 성질을 액체 성질로 변성시킨다. 그런 다음 온도를 확 떨구어 칼 모양을 서서히 만들어가며 단단히 강도를 높여간다. 중합효소연쇄반응 PCR 과정도 비슷하게 비유될 수 있다. 처음에 온도를 95도 수준으로 높여서 10초에서 50초 사이의 시간을 유지한다. 이런 공정을 통해 성질을 바꾸어 cDNA 사슬을 풀어서 2개의 가닥으로 만든다. 이런 점에서 이 과정을 변성denaturation이라고 말한다.

PCR의 둘째 프라이머 단계 혹은 프라이머 결착annealing 단계라고 하는데,,

사슬구조가 풀어져서 이미 변성된 cDNA의 두 개의 가닥 양단에 프라이머primer라고 하는 결착유발제를 붙인다. 프라이머는 20-30개 정도의 염기쌍을 갖는 아주 짧은 합성 유전자로 디자인된다. 유전자마다 고유하게 디자인된 프라이머 유전자를 탬플릿에 결합되도록 준비한다.

단단히 결착시켜서 복제 사이클을 원활하고 지속적으로 해주려면 열처리를 잘 해줘야 한다. 앞의 대장간 비유처럼 열처리란 온도를 높였다가 식혔다가를 반복한다는 뜻이다. 우선 PCR 첫 단계에서 변성을 하려면 온도를 높인다. 90-95 도까지 높여서 가닥을 푸는 작용이다. 그 다음 온도를 55도 수준으로 순식간에 낮추어 30초 정도의 시간을 주면서 결착을 강화한다. 마치 대장간 뜨거운 화로에서 갓 빼낸 칼 모양의 쇠를 단단히 하기 위해 찬 물에 갑자기 식히는 것에 비유된다. 물론 이런 비유는 말 그대로 쉬운 설명을 위한 비유일 뿐이다.

실제로 이 비유는 대장간 비유법보다 판금할 때 합판을 판에 단단히 결착하기 위해 온도를 높였다가 낮추는 것을 반복하는 것인데, 그래서 일종의 “판금” 방법에 비유될 수도 있다. 20여 년 전 PCR 초기 발상과정에서 annealing 이라는 말을 처음 갖다 붙였을 때 실제로 이런 비유를 통한 공정법이 도입되었었다.(“a manufacturing strategy analogous to replica plating” in Mitra and Church 1999)

PCR의 둘째 단계에서 프라이머 역할은,,

프라이머 결합 단계가 아주 중요하다고 하는데, 그 첫째 이유는 이 과정에서 이후의 증폭결과를 정량적으로 확인하게 해주는 수단으로 형광물질을 삽입하기 때문이다. 더 의미있는 둘째 이유는 PCR 절차에서 가장 중요한 DNA 중합효소polymerase를 넣어준다는 점에 있다. 그래야 복제 사이클을 유지할 수 있다.

중합효소에 의한 연쇄반응이란 말이 나온 이유는,,

그런데 여기에 흥미로운 점이 있다. PCR 1단계에서 사슬구조를 깨기 위하여 온도를 95도까지 올리는데, 그러면 사슬구조가 깨지기는 하지만 동시에 보통의 중합효소도 파괴된다. 그러면 두 번째 복제 사이클 둘째 프라이머 단계에서 다시 중합효소를 추가로 넣어주어야 한다. 만약 30회 증폭주기를 실행한다면 30번 매번 보통의 중합효소를 추가로 주입해야 하는데 이러면 PCR 진단의 속도나 비용 등의 실효성이 없어진다.

다행히 95도 고온에도 파괴되지 않고 활성화되는 중합효소를 찾아냈다. 유황온천에서 발견한 박테리아 Thermus aquaticus의 중합효소인데, 고온에서도 합성활성화를 유지한다. 그 이름 첫 글자를 따서 Taq 중합효소라고 부른다. Taq 중합효소 종류가 있어서 이후로는 중폭주기가 20회나 40회에 관계없이 최초 한번만 효소를 주입하는 것으로 PCR이 진행된다. 말 그대로 중합효소에 의한 연쇄반응PCR이 가능해졌다는 표현이다.

프라이머의 중요한 이유 또 하나는 프라이머는 고유한 방식으로 디자인된다는 데 있다. 특정 유전자에 특이적이라는 점이다. 나아가 바이러스는 종류에 관계없이 공통된 서열을 가지는 부분이 있는데, 이 부분을 프라이머 유전자로 디자인하면 바이러스 변이에 무관하게 PCR을 이용한 바이러스 감염여부를 확인할 수 있다. 프라이머 유전자에서 어느 부분을 프라이머로 디자인하느냐의 문제는 PCR 진단장비마다 다를 수 있지만 대체로 공통유전자 부위를 프라이머로 지정한다. 당연한 상식이다. 그래야 바이러스 변이체들이 바뀌거나 혹은 바이러스 부위별 단백질이 달라지더라도 PCR 작동이나 공정과정은 동일하며 따라서 검측결과도 마찬가지로 나온다. 다시 말해서 델타변이나 오미크론 변이에 무관하게 코비드 감염진단의 음성/양성 판단을 할 수 있다는 점이다.

PCR 과정 마지막 단계인 확장 단계는,,

셋째 단계로 넘어가 온도를 72도 수준으로 조금 올려 50초 미만 유지시간 안에 단일가닥 DNA 양단에 붙은 프라이머는 확장되어 원래 탬플릿 DNA까지 신장된다. 즉 프라이머 유전자가 자기동일성을 유지하며 길어진다는 뜻이다. 그러면 제대로 된 또 하나의 DNA가 탄생된다. 이런 복제 한 번의 과정, 하나의 사이클이 30번 이상 반복되면서 DNA 유전자는 검측할 수준으로 충분히 증폭된다. 이 증폭과정이 PCR의 핵심이다. 1983년 PCR 기술을 고안한 Kary Mullis 박사는 당시 30번 사이클 증폭주기를 통해 10억 개의 DNA 분자군을 합성했었다. 최근에는 더 짧은 시간 안에 (3시간 미만) 40회 반복을 통해 1조개 DNA로 증폭할 수 있다. 증폭된 DNA 생성수는 단순 계산으로 가능하다. 단일가닥이 쌍사슬구조로 합성되는 것이어서 1회 사이클마다 2배 증가하는 산술이다. (2의 10승 = 1024, 2의 20승 = 100만, 2의 30승 = 10억, 2의 40승 = 1조)

1983년도 멀리스는 기차를 타고 가는 중 머리 속에서 2의 30승 만 되면 검측이 가능할 것이라는 생각이 맴돌았다. 그리고 곧 논문으로 썼지만 당시 학술지 여러 곳에서(nature지와 science지 2군데) 사실성 미달로 논문게재가 거절되었다. 그는 크게 낙심했었지만, 딱 10년 후(1993년) 그는 바로 그 10년 전 PCR로 노벨 화학상을 탔다. (Weiss 2009)

그러면 증폭된 결과를 어떻게 우리가 확인할 수 있는가?

최근 PCR 진단기술을 따라 이름붙인 에서 볼 때, 위의 질문은 이 이름 앞에 붙은 “q”가 어디서 나온 말인지를 확인하는 것과 같은 맥락이다. “q”는 quantitative의 첫 글자이다. 과거 기술에서 벗어나 DNA 증폭된 정도를 정량적으로(시각적으로) 보여준다는 뜻이다. PCR 둘째 단계에서 DNA 단일가닥 염기 사이사이에 형광물질을 삽입한다. 그러면 단일가닥에서 사슬분자군으로 증폭될 때마다 형광물질도 증폭된다. 결국 복제 주기와 같은 비율로 증폭량에서 나오는 빛의 세기도 증가된다. 기하급수적 변화곡선을 시작하는 부위를 보여주는 비주얼로 정량화를 한 것 이다. 최근에는 이것도 자동화되고 있다.

증폭되어가는 DNA 복제사이클이 20회 이상되면 기하급수적으로 증폭될 것이다. 그러면 형광물질에서 나오는 빛의 강도가 정량적으로quantitative 그리고 실시간으로real-time 검측될 수 있다. 이점에서 어떤 PCR 진단기 업체에서는 이름에 real-time의 약자를 덧붙여 명명하기도 한다.

검체 샘플에 (코로나) 바이러스가 있었다면 그 바이러스 양에 따라 기하급수적으로 상승하는 빛의 강도 변화 그래프도 달라질 것이다. 즉 바이러스가 많을수록 기하급수적 변화시점이 일찍 표현되기 때문에 이 점에서 우리는 바이러스 감염의 음성/양성 판단을 용이하게 내릴 수 있다.

최근 오미크론 변이 바이러스 감염자가 PCR로 검측되지 않는다는 뉴스 기사가 많은데 사실인가,,

최근 오미크론 변이바이러스를 기존 PCR 진단기가 확진판단을 할 수 없다는 뉴스가 대세를 이루는데, 이는 전적으로 잘못된 오류이다. 일 년 전 델타변이 바이러스가 왔을 때도 마찬가지였는데, PCR 진단은 바이러스가 델타이건 오메가나 오미크론이건 무관하게 확진여부를 판단할 수 있다. 다만 확진자의 바이러스가 델타변이인지 오미크론 변이인지는 추후에 확진자의 충분한 유전체를 확보하여 유전자 서열검사를 하면 된다.

쉽게 말해서 PCR 검사는 DNA를 증폭시켜 바이러스 변이체에 무관하게 바이러스 자체의 존재여부를 말해주는 것임을 앞서 충분히 설명했다. 자세히는 앞서 말한 PCR 둘째 단계에서 말한 프라이머의 특징이 그 사실을 잘 말해준다.

혹시 괴물같은 바이러스 변이체가 생겨서 프라이머를 다시 디자인해야 되는 경우가 생기더라도 요즘은 관련 박사과정생도 이 작업을 어렵지 않게 수행할 수 있다. 중합효소를 다른 것을 사용해야 할 상황이 생긴다 하더라도 중합효소를 만드는 업체에 말하면 늦지 않게 다른 것을 배달해 준다. 뉴스에 속지 말아야 한다는 것을 강조한 뜻이다.

<참고자료>
Mitra, Robi D. and Church, George M. 1999, “In situ localized amplification and contact replication of many individual DNA molecules” Nucleic Acids Research Volume 27, Issue 24, Pages e34–e39, https://doi.org/10.1093/nar/27.24.e34

Weiss, Juan 2009, “Luminaries in Laboratory Medicine: Kary Mullis: Microbiology and Clinical Chemistry”, Laboratory Medicine, Volume 40, Issue 7, Pages 441–442, https://doi.org/10.1309/LM5SFGH3Q0NBJGWQ

코비드19 상업용 진단장비 글로벌 현황과 진단기술방법 분류표- 2021년12월2일 기준- 엑셀파일 다운받을 수 있게 공개합니다.

목록 페이지